提取果蝇DNA的新实验教学方法

引言

果蝇是遗传学科研和教学中被普遍使用的生物，因为它具有染色体少、已定位基因数多，突变性状多的优点，因此，它是研究基因分离、连锁交换、基因表达与调节的理想材料。提取果蝇DNA并对其特定的基因片段扩增是多个实验项目中必要步骤，被广泛应用于各种基础性或开放性的遗传学实验课程。

提取DNA的质量直接影响后续PCR扩增、限制性酶切以及基因测序的实验效果。采用常规昆虫DNA的提取方法去提取果蝇的DNA不仅耗时长、成本高，而且提取的效果不稳定，不适合本科的实验教学。南开大学遗传学实验课程组将常用的动物组织DNA提取方法改造后用于实验教学，建立了一种高效地提取果蝇DNA的新方法，取得了良好的教学效果。

实验过程

材料：实验中采用的果蝇携带有YAP基因

提取方法：

（1）常规方法一：将两支果蝇麻醉后置于1.5ml EP管中；加入50uL含proteinase K（质量浓度20mg/mL）的Squishing Buffer（SB）缓冲液后用研磨棒将果蝇充分研磨，如沾壁可稍离心；置37℃金属浴孵育30min，转入95℃金属浴孵育2min；10000r/min离心3min，取上清液作为DNA模板。

（2）常规方法二：用剪刀将100uL移液器枪头的尖部剪去少许后，用移液器吸取50uL质量分数为5%的Chelex-100溶液（预先摇匀）到EP管中，另加入2uL的proteinase K（质量浓度20mg/mL）；取两只麻醉后的果蝇于EP管中，用研磨棒充分研磨，涡旋振荡30s，于1000r/min离心1min混匀；将EP管置于56℃恒温水浴锅中水浴6h，再转入95℃水浴3min，14000r/min离心3min，取上清液作为DNA模板。

（3）高效法：去两只麻醉后的果蝇于1.5mL的EP管中，加入50uL NaOH碱裂解液（浓度100mmol/L，pH12），用研磨棒将果蝇充分研磨60s，使果蝇虫体全部碾碎；将EP管放入干式恒温中100℃孵育100min；之后加入50uL This-HCL（浓度40mmol/L）与原液充分混匀，经10000r/min离心2min，取上清液作为DNA模板。

DNA质量浓度及纯度检验：三种提取方法各设二次重复实验得到9份样品，分别取1uL DNA使用超微量分光光度计测定DNA质量浓度、A260/A280和A260/A230，比较三种方法提取的DNA质量浓度以及杂质情况。数据采用平均±标准差表示，并进行单因素方差分析，α=0.05。

PCR扩增：对提取的DNA的YAP序列进行PCR扩增。引物序列上游为TGAAACAGCAAGAACTGCTTC；下游为：CACCACTGCTCCCATTCA。PCR反应体系20uL，其中，含DNA模板0.4uL，上下游引物各0.4uL（10umol/L），ddH2O 8.8uL，Taq Master Mix 10uL。PCR扩增程序：95℃预变形3min；95℃变形15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃再延伸2min，最后保持10℃。

PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测：取扩增后的9分PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，评价三种方法的基因组DNA的PCR扩增效率。样品量8uL，DNA Marker 3uL，核酸染料为GelRed 3uL，电压100V，电泳时间20min。通过凝胶成像仪成像。

实验结果

1、DNA质量浓度及纯度检测

统计DNA质量浓度、、A260/A280、A260/A230、提取时长以及成本数据（结果如下表）。高效法和常规方法一对比的话，提取量十分接近，但浓度更高，重复实验的方差小，提取效果也更好；高效法和常规方法二对比的话，常规方法二的DNA质量浓度低并且数据的方差大，提取效果很不稳定，和高效法相比差异明显。

表1 三种方法的实验数据

通过测定A260/A280判断样品中的蛋白质污染情况，纯度较高的DAN的A260/A280在1.6-1.8，低于此范围说明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。高效法提取样品的A260/A280约为1.6，表明DNA纯度较高，蛋白污染较小，且方差最小，重复性最好；另外两种方法提取的样品A260/A280均低于1.3，蛋白质含量超标，说明蛋白质被污染。

通过测定A260/A230值判断样品盐离子干扰情况情况，若A260/A230小于2.0，表明有小分子和盐类干扰。实验结果表现是，三种方法提取的盐离子都比较多。

图1 三种提取方法A260/A280和A260/A230的显著分析（ns表示无明显差异，**表示P<0.01）

2、PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测

对YAP基因片段进行PCR扩增，三种提取方法获得的DNA扩增产物的电泳条带都比较明亮且单一，在1000-1500bp（图3）.三种提取方法获得的DNA样品都满足实验需求。

M：DNA Marker；1-3：常规方法一提取DNA扩增产物；4-6：常规方法二提取DNA扩增产物；7-9：高效法提取DNA扩增产物

图2 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳

总结

本文选用的三种方法提取果蝇DNA的质量均满足实验要求，并且高效法提取的DNA浓度和纯度要比常规方法质量更高，方差更小。高效法对比常规的两种方法，不因操作步骤少，提取时间更短，并且成本也极低，提取果蝇的DNA效果明显，非常适合实验和教学需求。使用高效法，能为后续的实验设计奠定更好的基础，推动课程建设。